Metodo sperimentale Modelli sperimentali nella ricerca biochimica. Sicurezza in laboratorio. Separazioni analitiche e preparative. Metodi di separazione di classi di biomolecole.
Principi ed applicazioni delle seguenti tecniche: spettrofotometria e spettrofluorimetria, ultracentrifugazione, cromatografia, elettroforesi ed isoelettrofocalizzazione, tecniche immunochimiche e tecniche bidimensionali di analisi delle proteine.
Approfondimenti:
Proteomica di espressione e proteomica funzionale, acquisizione e analisi di immagine, identificazione delle proteine mediante PMF (Peptide Mass Fingerprinting).
In dettaglio:
-Separazioni analitiche e preparative.
Disegno di un esperimento controllato. Standard interni ed esterni. Affidabilità di un metodo analitico: accuratezza, precisione, sensibilità (LOD, LOQ, LOL), selettività.
Modelli: organismi integri, organi perfusi, fettine di tessuto, colture cellulari, sistemi cell free. Metodi di rottura di tessuti e cellule. Purificazione di proteine per studi strutturali e funzionali (resa e indice di purificazione). Estrazione, tecniche di precipitazione frazionata, dialisi, ultrafiltrazione
-Tecniche centrifugative: Principi di base della sedimentazione, coefficienti di sedimentazione. Tipi di centrifughe e di rotori e loro uso. Ultracentrifugazione preparativa: separazioni sequenziali, separazioni in gradiente di densità zonali ed isopicniche.
Principali applicazioni: frazionamento cellulare, di lipoproteine plasmatiche, di acidi nucleici; criteri di purezza ed omogeneità.
-Tecniche spettroscopiche: spettrofotometria UV-Vis, fluorescenza, luminescenza, light scattering.
Spettrofotometria UV-Vis. Principi ed Applicazioni: analisi quantitative (metodi diretti e colorimetrici), studi strutturali, spettri differenziali. Spettrofluorimetria. Principi ed Applicazioni: analisi quantitative, studi strutturali, FRET, FRAP.
Applicazioni in campo biomedico: citofluorimetro a flusso e FACS. Dosaggi attività enzimatica; determinazione Km e Ki; uso diagnostico dei saggi enzimatici.
-Tecniche elettroforetiche
Principi generali. Elettroforesi zonale a basso voltaggio.
Gel Elettroforesi: materiali, apparecchiature, applicazioni.
Elettroforesi discontinua su gel PAA in presenza di SDS (SDS-PAGE). Determinazione delle masse molecolari apparenti. Elettroforesi in gradiente di poliacrilamide.
Analisi delle separazioni elettroforetiche, Tecniche di blotting, Analisi di immagine.
Elettroforesi capillare: principi, apparecchiatura ed applicazioni.
Isoelettrofocalizzazione (IEF): principi, apparecchiatura e applicazioni.
Tecniche bidimensionali di analisi delle proteine
-Analisi proteomica.
La proteomica di espressione (proteomica differenziale)
La proteomica funzionale.
Preparazione del campione da tessuto e da coltura cellulare
Tecniche di rivelazione degli spot (range di linearità dinamico, riproducibilità).
Acquisizione e analisi di immagine (normalizzazione, gel master).
Principi della identificazione delle proteine mediante PMF
Applicazioni in campo biomedico della proteomica
-Tecniche cromatografiche
Principi generali e applicazioni. Cromatografia di adsorbimento (AdC), cromatografia di ripartizione (NPC e RPC), cromatografia a scambio ionico (IEC), cromatografia a esclusione molecolare (SEC), cromatografia di affinità (AC). Cromatografia su strato sottile (TLC)
Principali applicazioni delle tecniche cromatografiche nella ricerca biochimica
Cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC): apparecchiatura, materiali, applicazioni.
Criteri di scelta del sistema cromatografico, risoluzione del picco, selettività ed efficienza.
-Tecniche immunochimiche: saggi immunologici, western blot, ELISA, immunoprecipitazione.
