DIDATTICA FRONTALE (3CFU)
PROTEINE RICOMBINATI IN PROCARIOTI
studio della funzione dei geni e produzione di proteine ricombinanti
Sistemi di espressione procariotici: Manipolazione della espressione genica nei procarioti. Caratteristiche dei vettori d’espressione procariotici: promotori forti e regolabili (promotore tac, lac e sistema binario pET). Le proteine di fusione. Miglioramento dei livelli di espressione delle proteine ricombinanti.
ANTICORPI E TECNICHE IMMUNUNOLOGICHE
SISTEMI DI ESPRESSIONE EUCARIOTICI:
Caratteristiche dei vettori per l’espressione in eucarioti. Definizione di cellule in colture. Tecniche per il trasferimento di materiale genetico negli eucarioti. Metodi chimici (trasfezione con cloruro di calcio o mediante lo utilizzo di liposomi).; metodi fisici (elettroporazione, microiniezione, genegun)
Lievito: S. cerevisiae e P. pastoris: Vettori per la espressione in lievito. Marcatori di selezione (complementazione di una auxotrofia).
Cellule di insetto: Il virus AcMNPV (Baculovirus) e le cellule SfN9. Cellule di mammifero in coltura. Vettori plasmidici e virali. Promotori per la espressione in eucarioti: minimi, forti, tessuto-specifici e regolabili. Il sistema Tet-ON/Tet-OFF e i promotori sensibili ad ormoni steroidei (tamoxifene).
Animali transgenici: La ricombinazione omologa e sito-specifica
I topi transgenici: Come si produce un topo transgenico, Topi transgenici inducibili
Modelli di topi con un gene alterato: Topi knockout, Topi knockin, Topi knockdown condizionali.
Altre applicazioni della tecnologia degli animali transgenici: Primati transgenici, Bestiame transgenico, Gene pharming
Clonazione mediante trasferimento nucleare e Applicazioni Piante transgeniche: Trasferimento di geni mediato da T-DNA. Elettroporazione e microbalistica
RNA REGOLATORI IN PROCARIOTI ED EUCARIOTI
La regolazione mediata da RNA in procarioti:
- ribointerruttori
- Sistema CRISPR-cas
La regolazione mediata da RNA in eucarioti:
- Meccanismi di silenziamento di un gene mediati da RNAi.
Applicazioni biotecnologiche degli RNA regolatori:
- la rivoluzione del sistema CRISPR/Cas9 e l''''editing del genoma
- Veicolazione di siRNA in vivo.
LABORATORIO (2 CFU)
Clonaggio della sequenza codificante per SOD1 nel vettore di espressione procariotico pET41b. Progettazione di oligonucleotidi per il clonaggio mediante PCR. PCR da templato plasmidico. Digestione con enzimi di restrizione. Ligasi. Trasformazione batterica. Estrazione di DNA plasmidico ed analisi mediante enzimi di restrizione. Espressione delle proteine ricombinanti in E.coli. Analisi mediante SDS/PAGE e colorazione con Blu di Coomassie.
Gel di attività per SOD1.
ESERCITAZIONE (1 CFU)
Cos''''è la Bioinformatica; le banche dati; identificazione di sequenze, disegno di primer specifici. La bioinformatica come strumento per l’analisi delle sequenze. I database NCBI (GeneBank, Unigene, PubMed, BLAST etc etc) ed ENSEMBL.
Il programma SNAPGENE per l''''analisi di restrizione di un frammento di DNA.
Strategie di clonaggio mediante PCR
